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產品內容
組分 | 6068S（20T） | T6068L（50T） |
A. BiotinTUNEL Reaction Buffer | 1 mL | 2 × 1.25 mL |
B. TdT酶 | 20 μL | 50 μL |
C. Streptavidin-HRP | 20 μL | 50 μL |
D. Streptavidin-HRP稀釋液 | 1 mL | 2×1.25 mL |
E. DAB顯色液A | 100 μL | 250 μL |
F. DAB顯色液B | 1 mL | 2×1.25 mL |
G. DAB顯色液C | 50 μL | 125 μL |
H. Proteinase K (2 mg/mL) | 40 μL | 100 μL |
I. DNase I (2 U/μL) | 5 μL | 13 μL |
J. 10 × DNase I Buffer | 100 μL | 260 μL |
UE-T6068S/T6068L1. 有些細胞或組織，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導致假陽性。建議：取出細胞或組織后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設置陰性對照。2. 內源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度。3. 固定液濃度過高或過低，導致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現不規則斷裂，產生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。4. TdT 酶反應時間過長或Tunel反應過程中反應液發生蒸發或滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應時間，并確保TdT 酶反應液能很好地覆蓋樣品。5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要徹底。6. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。◆為什么沒有染上熒光？1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現用現配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率.2. 細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內。細胞與冰凍切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片，適當調整。3. 延長標記時間至2h，并適當增加TdT酶及dUTP的用量。4. 確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應是否正確進行。◆如何對細胞核進行復染？可在TUNEL反應結束后對細胞核進行染色。◆為什么熒光背景高？1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證。2. TdT 酶反應時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當日使用。3. 處于高速分裂和增殖狀態中的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；4. 有些試劑或細胞存在自發熒光，選擇染料時要避開自發熒光的顏色。5. DAB 孵育時間過長，減少DAB 染色時間。6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結合，在TdT 酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。◆標記率低？1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。2. 固定時間過長，導致交聯程度過高，減少固定時間。3. 貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導致凋亡細胞容易脫落。建議：在凋亡誘導結束后，可以對多孔板進行1000g離心5min，然后再吸出培養基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續整個操作也需要輕緩。◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久？大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養時間根據組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長的蛋白酶處理時間。◆實驗的組織切片應該多厚？老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結腸厚度5–20 μm。
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